20世纪90年代，总有机碳TOC检测方法作为纯化水和注射用水水质的法定检测方法先后被美国药典和欧洲药典采用。我国在2005年版《中国药典》也引入了TOC检测方法，表明TOC检测方法在水质鉴定过程中是非常优良的鉴定方法。

 

 

清洁在GMP管理中是极其重要的工作，药品生产企业在对环境与厂房、设施与设备、装置与仪器、容器与器具的清洁必须要有经过验证和符合要求的标准操作规程，那么如何进行清洁验证就成为清洁标准操作规程制订的重要工作之一。由于当今制药设备的不断更新换代，程控化自动化设备的大量应用，设备的自动清洗和在线清洗装备与技术也被越来越广泛使用，这就需要更加精密的方法对这些清洗过程进行确认或验证，由于TOC检测方法具有其独有的优越性，将TOC分析技术应用于清洁验证管理中，不仅可实现过程分析技术，降低风险节约成本，同时能最大程度地确保清洁效果，防止药品污染。

 

 

对在线TOC分析作为清洁验证的方法进行验证，首先要对TOC分析仪适用性进行考查，然后对线性、擦拭回收率、检出限和定量限等指标进行考核，证明TOC分析方法的有效性。

实验中用到两种分析仪，两者都配有膜电导传感器。脱机分析仪使用的方法是以紫外和过硫酸钾氧化法为基础，而在线分析仪只用紫外线氧化。使用1,4苯醌和蔗糖的标准，采用USP系统的适用性试验来确定反应有效性，确保在线和离线分析仪的可靠性和可比性。

首先通过实验证明两个分析仪的适用性可以接受，进而使用脱机分析仪对具有代表性物质的牛血清白蛋白（BSA）进行分析，用来评估和量化以表面擦拭采样方法取得的总有机碳数值的系统误差和实验误差。溶解牛血清白蛋白（BSA）10％，分别准备500、1 000、5 000、7 500、10 000 ppb的TOC的目标浓度。对这些溶液进行分析，确保BSA的总碳响应曲线呈线性，并且和经验特征样本的碳含量符合，建立TOC与牛血清白蛋白的浓度关系。样本分析产生的响应曲线如图1所示。通过数据点描绘出线性回归线，趋势线显示了线性的关系。回归直线的相关系数（R2=0.999 8）表明，回归直线拟合数据，是一个合理的模型。

图1 BSA回归线

通过将已知浓度的BSA涂抹在不锈钢片上的方法确定BSA表面拭子回收特性。目标有机碳负荷在表1中由样本编号显示。为计算个体差异，采用3个技术员独立执行拭子采样方法进行研究。擦拭取样回收评价通过比较做出，即将（不锈钢）片中回收的碳总量与阳性对照标本中总碳量做比较。表1总结了试验结果，在图2和图3中以图形显示。

每个技术人员所得的相关系数（R²）＞0.99保证当考虑了个体差异时仍使回归情况满足线性模型。每个技术人员对抽样方法的检出限和定量限如表1所示，范围分别为122～195 ppb及371～589 ppb总碳量。每个回收曲线斜率也具有代表性，对于所有表面擦拭回收情况都超过了指示范围，平均而言，每个技术人员，在测试的范围内可以回收剩余在过程中内表面＞80％的牛血清白蛋白BSA残留物。

表1  表面擦拭回收结果

 

TOC回收量/ppb

TOC阳性对照品/ppb

 

                      图2 单个技术人员擦拭回收结果

图2中每一行的斜率显示通过每个技术员负载的残留物总回收。此外，每个人回收结果相对标准差被用来作为主要统计点来评估结果的精度和每个技术人员数据的可靠性。通过回顾离散相对标准偏差数和每个技术人员的R2值，发现有些变化是预料之中并且是明显的。将技术人员所有数据套入可以建立一个模式，包含固有的系统误差以及个体差异。为了证实这一假说，对设置的三个数据进行测试，结果证实所有为技术人员设置的样本产生数据可以使用，因为他们在统计上满足同样高概率抽样方法的要求。

对检出限和定量限进行评估，可以使用两种方法。

一是运用下面公式：

式中  s——标准曲线的标准差；

m——回归直线的斜率。

s可以从多种途径被决定：回归线标准差，线纵坐标Y的标准差和一定数量的空白反应标准差。

对所有的技术人员的汇总数据进行分析，图3以 0.986的相关系数显示了大约90％的整体回收，得出总体检出限为160和定量限为486 ppbTOC。

 

TOC回收量/ppb

TOC目标值/ppb

图3  TOC表面特性擦拭采样方法（BSA整体擦拭恢复）

同时采取另一种方法估计检测限，通过计算擦拭10个清洁的不锈钢片的棉签所含的平均结果。这种方法需要通过水、试管、棉签及其他随机试验进行。通过测试，10个清洁不锈钢片棉签中所含TOC平均是161，标准差为9.3％。因此，由两种方法检测的最小检出量几乎是一样的。以擦拭最低检出量的TOC作为清洁结果的限度，对过量的擦拭检出量值进行评估，以确定是否是实验失败的根源。

实施TOC作为在线过程分析技术，要求该分析技术和方法对应用程序具有适用性。首先对安装在GMP生产设备上的在线总有机碳TOC分析仪进行风险分析来确保安装本身不会对生产过程和药品产生负面影响，在此过程中，安装的位置、物理性质及在线TOC分析仪与清洁系统管道连接的自动化程度都是要考虑的重要因素，因为这些因素会影响到实验测量的准确性和重现性。安装完毕后，要将在线监测结果和现有的常规测试方法结果相比较，来证明TOC分析法的效力和适用性。在此基础上，将TOC分析法用于检测清洁后在最后冲淋水中的工艺和产品残留进行清洁验证。

 

 

TOC方法是通过检测水中有机碳含量来推算水中杂质的含量，以判别水质是否达到纯净级别的要求。在清洁验证中，通过擦拭取样或最终淋洗水取样，检测水中的有机碳含量，从而验证某种清洁程序是否使污染物残留量降到标准值以下，即清洁方法是否有效。在对分析方法验证的基础上，通过对3种不同设计的底部安装搅拌器的反应釜进行清洁验证，采取3种清洁采样方法，即棉签擦拭人工直接采样，通过冲淋水间接采样离线分析以及冲淋水采样在线TOC分析清洁验证，通过实验数据对清洗过程进行评估，探讨在线总有机碳TOC分析技术的优越性。

基于仪器的性质和CIP特质来选择合适的TOC分析仪，确保在线清洁CIP的工艺条件下不干扰分析结果。由于企业很少有机会定制在线TOC分析仪功能，因此要选择有适当的氧化和传感器设备的分析仪满足具体的CIP操作需求。将CIP特质与合适的氧化和传感器设备组合匹配起来才能产生强大的在线分析仪的应用功能，实现清洁过程中操作和验证工作的最小化。在线分析仪产生的结果可能会被离子、样品压力或温度的变化引起的干扰所混淆，防止这一干扰的方法是通过测量无机碳（IC）或总碳（TC）氧化成二氧化碳得来的电导率结果，能完全有效地消除干扰源。

由于在线总碳量TOC分析仪要直接检测在线清洁回路管道的样本，因此要关注样品的压力和温度参数。要确保在回路管道里有足够压力满足所要求的样品浓度同时能防止分析仪受到的压力超出制造商的建议。在运行过程中必须密切注意分析仪的配置、尺寸规格和自动取样阀安置位置及从CIP系统返回的管道里的样本线连接。特别当分析方法是电导的情况下，温度波动是选择分析仪的另一个重要关注点。因为电导率是依赖温度的测量方法，仪器制造商以不同的方式提供技术支持。样本流温度变化可通过温度补偿电导率传感器，或用样品仪测量原始电导数据，在测量过程中要考虑通过环境损耗或积极的热交换产生的温度平衡。

图4为用来比较3个不同设计的搅拌器的清洁性的在线清洁测试系统。该在线清洁测试系统组成包括供水水箱、热交换器、自动阀、变频调速（变频）控制的泵和1 000 L容器，容器内装有用于测试的搅拌浆叶。通过PID控制器控制温度和流量的关键参数，同时严格控制每一次投料数量和洗涤剂的浓度，以确保每次清洁运行的一致性和重复性。

图4 在线TOC分析用于在线清洁系统示意图

TOC分析仪设在阀V-8处，每次运行时从阀V-8处抽取最后冲洗水样本，分析后的数据以模拟图输入信号AI-1。所有用于比较的人工取样的样本来自阀V-9，直接位于TOC分析仪样本行旁边。为了提供一个参考点，每次运行时供水从V-11人工取样。在每个容器相同部位安装相同的搅拌桨叶，运行同样的清洁程序和参数。

将BSA手工涂抹到容器内壁以及全部搅拌桨叶使其污染后烘干。干燥后开始进行在线清洗循环，包括初步冲洗、碱性洗涤、中间漂洗、酸性洗涤和用纯净水的最后漂洗。每周期以SterisCIP-100，1％浓度清洁剂用于碱性清洗，1％磷酸用于酸性清洗。

因为TOC在线分析仪需要在一个短暂的平衡期后才准备样品，一轮冲洗持续时间不足以使分析仪完成准备，因此第二次最后冲洗开始时TOC分析仪进行取样。手工取样也在最后冲洗开始时进行。清洗循环结束后，进行擦拭取样。最后将手工取得的冲洗液和擦拭样本与在线TOC分析仪的取样进行比较。

通过图5中对人工取样和在线取样结果进行分析评估的数据，可以得出人工取样和在线取样进行分析的方法具有可比性。线上结果与表面擦拭样本的TOC数值也具有可比性。供水、人工取样和在线取样的结果具有明显相关性，最显著的是第7次运行结果。第7次运行时供水被满溢的平顶供水缸意外污染，污染通过容器的盖子和密封处传递到溶液中，这种情况下，抽样方法检测到了偏移。

图5  人工在线对冲洗水取样TOC比较

图6显示了擦拭取样、人工取样和在线取样检测的结果：总的趋势一样，仅在第3次运行中，表面擦拭结果明显高于在线取样和人工取样。这可能是由于仍有未被完全清洗的BSA残留物在设备内表面而没有完全溶解于最后冲洗水中。所有运行的数据表明，无论是在线还是人工取样的冲洗水样本，都显示出了设备表面的残留量。

 图6  在线取样与直接和间接取样的比较

试验中还发现一个现象，即由人工取得冲洗样本的TOC值比在线分析仪上取得的低，这与我们预期恰好相反。由于人工取样时间先于在线分析仪取样时间，因此人工取样TOC结果应该高于在线样本TOC结果。通过研究我们认为可能有两方面原因：一是由于在线分析仪采样发生于再循环冲洗时，而再循环冲洗水会经过其他通路表面，而这些通路通常不进行最后一次冲洗，因此可能出现更多TOC，这是典型CIP方法可能带来的偏差。二是由于在线分析仪上取样管道的构造不合理所致。TOC分析仪取样阀V-8是面向下方，没有额外的排水渠或排水阀可以排出管道里的溶液。而人工冲洗取样阀会在取样前按照抽样方法程序进行冲洗来清洗掉可能导致TOC值升高的取样管中的任何残留。因此在取样前进行残留清洗工作是必要的，要在样本采集和分析前清洗通路，同时可以对在线取样管道进行合理改造。

通过实验研究证明，在线TOC和电导率监测的结合能够实时确认清洁循环情况，可以利用过程控制统计的方法对关键控制参数和清洗过程质量属性进行分析。这种持续的监测可以作为评价漂移的基础，也是确定再确认时间的依据，这种再确认是基于事件本身而非基于时间，更具有科学性和预防性。监测所得的数据为清洁验证提供依据，以每一次运行为依据，通过清洁周期表现得出的证据来确保产品生产运行前清洁工作成功。

 

 

根据上述研究，将在线TOC分析应用于清洁验证过程是可行的，但要做好前期工作。首先要仔细选择合适的分析仪来实施在线TOC的采样和分析工作，这种分析仪要与清洁过程相符合，并且在安装后可以通过实验证明其检测结果能真实反映最终冲洗水中TOC的水平。选定的TOC分析仪还必须能耐受清洁剂中的导电离子，同时能对偶尔＞1～2×10^-6的TOC高峰进行分析，具有可靠性。      

在本项实验中，先进的氧化微分导电膜传感器被证明可以用于进行在线CIP冲洗水的分析。但如果应用过程存在导电离子并且TOC浓度很少超过2×10^-6的情况下则不适用这种分析仪，可能会使用一种高级氧化的工具，能通过直接传导来测量TOC。对于TOC的浓度超过2×10^-6同时具有离子导电的可能性时，最终用户可以考虑使用过硫酸钾氧化系统带一个非色散的红外线探测器（NDIR）或者微分膜导电传感器。在应用中还应注意，要在CIP系统上配置能迅速将溶液传递到分析仪管道的采样设备，防止溶液被带到下一次运行中。最好的方法是当设备不使用时通过适度震荡将样本线里的液体完全排空。

一旦满足上述要求，TOC分析仪可以识别清洁过程的趋势，以供管理者采取及时的纠正措施。在应用在线TOC分析对清洁效果进行持续监测前，要对使用的仪器和方法进行脱机验证，使用符合药典要求的抽样及其他分析方法进行同步确认。只有在线TOC取样和分析工作获得的结果经验证相当于或者比现有方法更好的时候，才能将其应用于清洁过程中。

虽然有人认为，在线检测TOC需要额外要求，即在最终冲洗水中TOC水平要超过可接受的限度，但是在线TOC检测办法能够鼓励和提高过程知识水平，而这些知识可能影响对关键过程的判断。通常情况下，一旦系统被验证，并非每次运行都要对冲洗水样本采集测TOC，除非系统性能不佳或者只有非常低的风险承受能力。

CIP系统主要关注过程，依靠监测和控制关键参数（如温度、流速、电导率等），来确保清洁循环在设置和验证认可的范围内。这种方法有效地关注清洗过程输入端，但对于最终清洗水中的TOC——影响清洁的关键因素通常缺乏关注。利用在线TOC分析仪将最后冲洗水在线检测，得到的TOC数据能为CIP提供更完整的资料，来评估每次运行的清洗效果，从而进行全面和持续良好的控制。

对影响清洁效果的关键质量属性利用在线TOC分析仪进行监测和控制可实现更多的质量和经济利益，主要体现在减少和消除清洁有关的偏差和由此带来的调查和决定工作。因为许多生产企业的清洁验证样本是由手工采样并提交到质量控制实验室分析，或在某些情况下提交到外包合同实验室。这些活动涉及企业以人工取样获得数据的时间和费用，取样材料，质量控制实验室的时间和资源，以及由于从等待分析结果到决定清洁过程是否合格需要的时间延误生产带来的相关的机会成本。这项研究也将人工取样分析所需时间和在线分析仪取样分析所需时间进行比较，进行的9次清洁运行中用于取样准备和对样品进行分析总时间超过了80 h，而对于在线TOC分析仪总共花费时间为3 h。以一次运行为例，人工取样和分析需要接近10 h，而在线分析的准备和取样分析仅需20 min。显然，以此次运行推断一年甚至更久的运行时间，可以节省大量时间。

尽管将在线TOC分析融入CIP系统自动化导致资金成本增加，但运营成本可以显著降低，通过更有效的过程监控实现更快和更灵活的生产计划，使手工操作需要的劳动时间最短，能为企业带来更多的质量和经济效益，因此具有实施可行性。